“克隆猴之父”详解瓶颈：方针是把猴体细胞克隆成功率提升到10%以上

全球首对体细胞克隆猴“中中”（左）和“华华”（右）。我国科学院脑科学与智能技能杰出立异中心供图

【编者按】在上海市科学技能委员会赞助（项目编号：22DZ2304300）下，汹涌新闻联合《世界科学》对取得国家及上海市科技奖赏的效果进行科普化报导。

本篇报导环绕2022年度上海市天然科学一等奖项目“ 非人灵长类形式动物构建”打开。该研讨由我国科学院脑科学与智能技能杰出立异中心研讨员孙强、刘真、仇子龙、张洪钧完结。

“拔一根毫毛，吹出猴万个！”《西游记》中孙悟空的这一才干生动展现了什么是“克隆”。

克隆，可以浅显地被了解成“复制”，“像是复印出来”一个或一个个彻底相同的个别、单元。

而这与“龙生九子”天壤之别：克隆，越过了两性生殖进程，也越过了前者可能发生的遗传物质的“组合”或变异。

2017年年末，一个世界级效果：全球首例体细胞克隆猴，在我国诞生。相关论文随后于2018年1月25日在世界学术期刊《细胞》（Cell）上在线宣布。这一音讯其时就引爆了整个学术圈和科研界。

此前，全球科学家经过数十年的尽力，但一向未能霸占非人灵长类动物体细胞克隆的难题。

直到两只体细胞克隆猴“中中”“华华”诞生在我国科学家手中。

这一技能的打破，意味着人类可以凭借克隆猴技能，揭开更多生命科学的奥妙，比方灵长类的发育、大脑以及多种疾病相关难题。

但即便到了今日，克隆猴技能仍然存在瓶颈，成功率仍旧不高。

近来，我国科学院脑科学与智能技能杰出立异中心非人灵长类研讨渠道研讨员孙强承受了记者的专访。

“咱们做克隆猴，意图是更好地构建非人灵长类形式动物。”孙强说，“形式动物”的“形式”是什么？便是像用一个模子刻出来的。

为什么需求克隆猴？

在克隆猴诞生前，山公也被用于转基因或药物测验等研讨。但这些山公都是由受精卵发育来的。

“但它有一个问题便是，它们的基因型是不同的，各个山公之间的遗传布景不同。”孙强表明。

“再举个比方，比方说用考试去挑选一群学生，咱们要给这些学生相同的考卷，对不对？不然100个人参加考试，有100张不同的考卷，你怎样点评谁的水平高，谁的水平低？咱们筛药也是相同。你这个药好不好，你得用相同的‘试卷’点评。这样才干削减样本间的差错。这时分，药便是这些‘考生’，山公便是这些‘考卷’。筛药时运用的猴模型，比方说基因修改和转基因的猴，假设它们的基因型有不同，致病基因可能在表达水平上有差异，遗传布景有影响，那么就把这个问题杂乱化了。克隆技能正好可以处理这一难题，让它们遗传布景又共同，基因型又共同。这样就可以让它真实变成形式动物。所谓形式是什么？便是用一个模子刻出来的。”

克隆猴供给了简直完美的模型。猴是灵长类，是生命演化中最挨近人的动物。

“比方，假设我有一批A基因突变的山公，其他一切布景都相同，仅仅A基因有差异，假设跟对照比较，一个药物可以缓解A基因突变导致的症状，那么就可以承认这个药是对的。”孙强说。

除了测验药物，根据这一简直完美的动物模型，人们可以进行新药的研制，以及探究生命科学更多不知道的边境。

其实，“克隆”无处不在。植物的无性繁衍，比方插条、嫁接、落叶生根等，都是“克隆”。

人类也在很早就开端测验克隆各种动物。但非人灵长类动物，比方山公的克隆始终是个难题。

早在20世纪初，德国动物学家、试验胚胎学前驱汉斯·斯佩曼（Hans Spemann）现已运用胚胎割裂技能克隆出了蝾螈。

胚胎切割技能作为前期探究阶段的技能，当然是不完美的，它的功率很低，因此没有成为动物克隆范畴的首要方向。孙强表明，“你可能在二细胞期或四细胞期切割，你最多也就别离出4个细胞。假设全部都变成个别，最多也就变成4个个别。但实际上，四细胞期有时分也就出世存活一个或许两个，所以说现在胚胎级克隆的克隆数有限。而体细胞克隆，理论上是无限的。”

所以，现代的动物克隆技能的干流是“核移植”，特别是体细胞核移植——给卵母细胞（卵细胞）换一个细胞核。由于胚胎细胞在数量上的局限性，体细胞是更好的核来历。效果便是，一个细胞核，对应着克隆子孙的一个小生命。

1928年，斯佩曼测验将蝾螈胚胎细胞核转移到卵细胞中，尽管终究没有克隆成功，却是“移核”的初次实践。

1962年，英国牛津大学的科学家约翰·戈登（John Gurdon）将非洲爪蟾肠上皮细胞的细胞核移植到蛙卵细胞里，并培育出蝌蚪。其试验成功率只要2%。

1996年，克隆羊多利诞生。277次核移植，只发生29个胚胎，最终有且只要多利走运地出世了，这个成功率比非洲爪蟾的2%还低。但多利的诞生，打破了“哺乳动物体细胞无法分解”的成见。

随后，猪、牛、狗等动物的体细胞核移植克隆都被完成。

但克隆猴一向“胎死腹中”。

克隆猴不是仅仅为了克隆猴。克隆猴诞生之初，研讨团队负责人蒲慕明院士说：制备克隆猴不是为了猎奇，更不是为了克隆人，而是为了树立非人灵长类疾病动物模型，为研讨人类疾病机制和药物研制带来期望。

我国科学院脑科学与智能技能杰出立异中心非人灵长类研讨渠道研讨员孙强。

愚公“移核”与克隆猴的瓶颈

在体外人工构建一个生命体，何其难？

生命的繁衍进程太杂乱了。

“应战太多了！”孙强说，“不用说培育一只山公，便是从胚胎，不依赖任何母体，直接培育出一只老鼠，那都是十分震慑的作业，意味着（哺乳动物）生命可以在体外培育了，那是真实的试管了。”

他表明，“现在，前期胚胎的一切发育还没彻底搞清楚，子宫是怎样确保胎儿养分的，器官在子宫内是怎样分解的，什么诱导了器官的对称发育……没有答复的问题太多了。”“脱离子宫还做不到，你怎样模仿一个子宫的环境？早产儿，毕竟在母体里怀孕到150天或许更长时刻，挨近出世，各个器官都发育完结了，可是要真实变成从一个受精卵一个细胞开端彻底培育、发育长出来很难。假设那个能做出来，远比克隆要震慑得多！”

所以，现在要克隆猴，仍是要“借腹”：依托卵母细胞，构建一个重组细胞，激活，移植到代孕猴的子宫内，然后待产。

孙强介绍，2003年，美国匹兹堡大学教授杰拉尔德·沙滕（Gerald Schatten）依托美国俄勒冈灵长类中心，从前一次性做了700多个卵，然后移植到30多只山公体内，最终都没生，他其时很绝望。俄勒冈灵长类中心的另一位教授舒克拉特·米塔利波夫(Shoukhrat Mitalipov)觉得这可能是技能问题。2007年，他承受一个杂志的采访，说他现已用了15000枚卵来做克隆猴。到2010年的时分，他发了一篇论文，便是把克隆胚胎移到10只山公体内，可是只要1只怀孕，并且怀孕到81天，这个山公流产了。

“咱们一共用了挨近五年时刻去处理这些问题，前边都是失利、失利、失利，最大的失利呈现在2017年的8月。”“8月的时分，咱们就得到了两只克隆猴，一只在140多天的时分生出来，活了三个小时，没有肺呼吸，死掉了；另一只活了30个小时也死掉了。那个时分咱们的绝望达到了极点，就像买彩票，彩票中奖号码是10个，第1个号码到第9个号码都是对的，然后到第10个号码忽然错了。”

他们从失利中走出来，2017年年末，总算成功做出了全球首例体细胞克隆猴。

孙强介绍，“实际上，由于体细胞很小。山公的卵母细胞直径110微米，很大，体细胞直径大约就十几个微米。咱们没有取核，它带的细胞器和线粒体也很少。咱们是直接把整个别细胞交融进去了。咱们检测过，‘华华’细胞中来自供体猴体细胞的线粒体挨近20%，‘中中’的大约不到3%。”

“现在的问题是，其实克隆的功率仍是很低的。山公体细胞的表观重建的机制，以及前期胚胎的表观遗传学改变还不清楚。我觉得，最首要（作业）的首先是，把山公的表观遗传学机制解析清楚。在此根底上，真实进步体细胞克隆的功率，期望能把现在大约3%左右的水平，进步到10%或以上。”

孙强说，“在2024年年头，咱们发了一篇文章，在克隆恒河猴时，咱们处理了胎盘的发育问题，经过滋养层细胞置换，把克隆胚胎移植出世功率从2%进步到9%左右，进步到了四倍多。”

孙强表明，克隆不是一个天然发育的进程，要打破许多妨碍。经过这个克隆进程中，人们可以了解胚胎前期发育的，特别表观遗传学层面的生物学机制，这也是对生命的知道。

现在，孙强团队正在用多组学和测序的办法来剖析，细胞根底表观的改变是什么样的，克隆时什么样，来调查各种调控进程的振动。

科研三阶段：试管猴、转基因猴、克隆猴……

“有人跟我联络，说他养的宠物狗不行了，能不能把它克隆出来。国内有公司在做。我做的是克隆猴，不会做克隆狗。”孙强说。

在一次讲演中，孙强说到他研讨进程中的三个阶段：试管猴、转基因猴、克隆猴……

他说，在云南省的西双版纳州澜沧江岸的一座山上，他作业了4年，一向待到2008年。

那是一个973国家重点研制项目，他接手的时分，项目现已执行了一半。由于2001年转基因猴技能系统现已树立了，所以项意图方针是期望做出转基因猴。他是半途去的，方针是至少要做出试管猴，假设能做出转基因猴更好。

他记住十分清楚，2007年立春的2月4日当天，他们就做出了我国榜首只试管猴，之后又做了十几只山公，可是很惋惜，没有一仅仅转基因阳性的。项目完毕今后，由于没有资金的支撑，他从山上撤了回来。

回来今后，在上海待了半年多。很走运，一个时机呈现了。我国科学院神经所的蒲慕明先生找到他，让他持续做山公。

这次是姑苏太湖的西山岛，上面有一个很大的猴场，1万多只山公，他就到岛上去陪山公了。

在孙强的叙述里，作业人员要做的一件作业是要看山公的月经。岛上的试验室大约有几百只山公，每天都要看山公的月经。每次山公“超排卵”都要打针，从月经来的榜首天开端，一般要打12天，一天打2针。

孙强介绍，小白鼠接连20代近交，得到近交系，遗传布景是共同的。小鼠的繁衍周期大约是半年，接连20代也就顶多10年时刻，这件事在上个世纪初就做完了。但山公的繁衍周期、性成熟时刻、传代时刻要5年，做20代就要100年，“没人能做得成”。

这便是人们为什么需求克隆猴：要越过近交，要缩短这100年。

在世界首个别细胞克隆猴效果新闻发布会上的陈述中，孙强表明，体细胞克隆总结下来有四个节点：构建胚胎、激活胚胎、发动核基因组、着床后发育。除了最终一个节点无法控制，前三个节点都可以干涉。只不过，每一个节点都是一座“大山”。

起先，团队里其他成员都是兽医，包含取卵在内的大部分精细试验操作都由孙强一人承当。

据我国科学报报导，即便在2010年国庆假日，孙强在雨夜骑车出车祸、锁骨骨折，他也忍着疼痛花十天做完原定的取卵试验才住院手术。绝大多数时分，大多数方针都不值得以健康为价值的投入，但在该项异常的研讨面前，孙强以为他有必要这么做。

走运的是，研讨生刘真在2010年参加孙强团队，次年开端在岛上日子，并很快生长为主干。

据媒体揭露报导，刘真花了两年时刻操练并优化构建胚胎的流程。他刚开端是在小鼠卵母细胞上操练，每天操练8到10个小时，差不多接连操练了三四个月。后来，他又转到难度更大的山公细胞上操练——眼睛看着显微镜，两只手操作，脚也有操作使命。四肢并用练到2014年末，刘真的相关试验操作技能登峰造极，去一个细胞核均匀只需求10秒钟，而注入相同用时甚短。现在，除了刘真，我国科学院脑科学与智能技能杰出立异中心非人灵长类研讨渠道现已具有一支可以娴熟进行体细胞核移植的部队。

孙强表明，只要精深的技能，才干确保对卵母细胞损害最小。

为了进步激活胚胎的成功率，孙强团队还测验了多种激活条件，一开端运用只要13%囊胚率的离子霉素+6-DMAP，后来运用组蛋白乙酰化酶抑制剂处理，囊胚率进步到16%。学习一篇2014年宣布的论文中的研讨办法，他们用H3K9me3去甲基化酶Kdm4处理，囊胚率进步到45%。

孙强团队还测验了不同来历的体细胞来构建胚胎。最终，他们发现成纤维细胞是最好的挑选。也正是用成纤维细胞核，他们成功克隆出了“中中”和“华华”。

孙强表明，“追求真理，坚持好奇心。”克隆猴“中中”“华华”仅仅个起点，他期望，在这个根底上能做出更好的非人灵长类形式动物。“我还要感谢一下我的家人，由于这些年，跟山公在一起的时刻，比跟他们在一起的时刻都多。”